DNA shuffling是一种基于PCR技术的、新的体外定向分子进化技术。它利用DNasel将欲改造的基因或基因家族打断成一定的大小的片段,在PCR变性后的复性过程中,利用片段间具有的部分同源性发生错配。错配的片段互为模板进行延伸。而与此同时,不同来源的基因间也可发生重组,形成融合基因。经过反复的变性、复性(错配)和延伸(重组),直至扩出全长基因。这些基因在延伸中因为错配引入了突变,通过重组使基因融合,从而创造了新的基因。再通过人类的定向选择,最终可以得到一些符合人类需要的新基因。

大多数生物体进化都来自于自然选择和性繁殖,其中在真核生物性重组便是生物进化的一种主要方式。早在1990年, Marton和Meyerhans等人就已经发现在体外PCR中存在的DNA重组现象,并指出该重组现象是由DN A断裂或出现切口引起的。1994年美国的Stemmer 等以LacZα基因为实验材料,用DNase I进行消化,得到10～ 70 bp大小的随机片段集合, 在不加入引物的情况下, 利用PCR得到了全长的LacZα产物,从而以巧妙的设计验证了体外PCR中存在的DNA重组现象。Stemmer 将该技术称为体外DN A shuffling 技术,并于1998年申请了专利。由于该方法一定程度上模拟了生物体自然进化过程中减数分裂期等位基因间的DNA片段互换(有性交换, sexual exchange) ,故DNA shuffling 又被称为有性PCR(sexual PCR)。

DNA shuffling 技术是一种利用多次、反复选择和重组以获得具有预期性状的多聚核苷酸的方法。其原理大致如下: 先将由多种同源核苷酸序列组成的模板(初级文库)进行随机片断化,所产生的随机片段集合包含了至少1000种以上寡核苷酸,这些寡核苷酸来自不同的同源序列,具有不同的3′末端,这一点是下一步随机重排的前提条件。利用PCR技术在不加入引物的情况下对这些随机化片段进行重新排布: 在起初的几轮循环中, 具有互补3′末端的来自不同模板序列的寡核苷酸互为引物,扩增出一段较长的核苷酸产物; 接着下一轮循环时,以上轮产物为模板,又将产生一段更长的核苷酸产物,随着扩增数递增,模板的不断变化,产物长度亦在不断递增,如此,经过多轮扩增,最终将获得多种低拷贝的全长的重排产物,这些集合的重排产物又被称为嵌合文库(突变文库)。对嵌合文库进行筛选,选择改良的突变体组成下一轮shuffling 的模板(次级文库) ,重复上述步骤进行多次重排和筛选,直到最终获得性状比较理想的突变体。

利用随机化片段的重新排列组合产生多样化的突变文库是DNA shuf fling 技术的精髓所在,这一点有点类似assembly PCR。其优点是: 可以在体外实现同源序列间的重组,并可能实现那些对进化有利的点突变的优化组合,最终获得性状改良比较理想的突变体。

目的性状的确立和模板的来源

目的蛋白的改造必须针对一定的表型特征,即要针对特定的目的性状,包括结构和功能方面的特性。如荧光蛋白的荧光强度、最大波长及酶的催化能力、热稳定性、底物的专一性等。此外,一些DNA调控序列,如启动子、5′UTR、3′UTR等也可以作为靶序列进行改造以改善其调控功能。模板可以由多个同源序列或同源基因(如家族基因)组成初级文库( primary libiary ) ,也可以单个基因组成。后者在DNA shuffling 之前要先利用其它突变方法对单个基因进行突变, 或在DNA shuffling 的同时借助聚合酶产生的点突变以产生多样性的突变产物。同源靶序列的长度在50 bp～ 50 kb之间,一般通过PCR获得,反应后应除去多余的引物, 以提高重组效率。

随机片断化处理

初级文库(模板)用DNase I或多种内切酶处理后,获得随机片段集合。随机片段大小应在20～ 500bp之间为宜。并对片段集合进行纯化,除去未消化的模板,以避免原序列的污染。

无引物的PCR扩增

在不加引物的情况下,将以上片段集合置于适当的PCR系统中进行PCR扩增。该步要求片段集合有较高的总量和浓度,同时还要求PCR反应有较高的循环数,以保证产生多样性足够好的嵌合文库(突变文库)。

加入引物的PCR扩增

上一步的PCR产物按一定比例稀释,同时加入两外侧引物, 选用较少的循环数, 如15轮, 进行PCR扩增,便可获得大量的全长目的基因,即放大的嵌合文库(突变文库)。有时PCR产物中还可能存在全长目的基因的线形多拷贝聚合体,如Stemmer等对全长2. 7 kb的pUC19质粒进行DN A shuffling 时,得到的产物大多在20 kb以上,但用适当的内切酶消化后,即得到均一的全长目的基因。

克隆、筛选、分析及多轮筛选

PCR产物用适当的内切酶处理,克隆到表达载体中并转入宿主细胞(如大肠杆菌,噬菌体等)中进行表达,在特定的选择压力下,选择目的性状改良的突变体; 将选择到的突变体混合在一起,作为下一次DNA shuffling 的模板(次级文库) ,选择压力不断提高,重复1～ 5步骤进行多次选择和重组,直到最终得到性状改良明显的理想的突变体为止。在进行DNA shuf fling 时,最重要的是选择合适的筛选模型,只有选择的模型恰当,才会减少工作量,快速地实现预期目标。如欲提高酶的热稳定性,应以不断递增的温度为选择压力,通过突变产物(酶)对底物的活性变化来筛选热稳定性改良的酶;如果改造对象是细菌的酶,还可以选择该酶缺陷的细菌为宿主细胞进行筛选。

自Stemmer提出DNA shuffling 以来, 这种体外DNA 重组的方式引起了各国学者浓厚的兴趣, 包括Stemmer本人在内的许多学者提出各种改进方法, 使DNA shuffling 技术更加多样化, 在不同需求的引导下发展出了一些各具特色的新方法。

DNA-family -shuffling

DNA-family -shuffling 技术是根据自然界中存在许多物种来源不同、基因序列有所差异但功能相似的基因家族建立的, 用于改组的基因家族中的一组基因, 可以是来源于同一物种的某一基因家族, 也可以是来源于不同物种、属间有一定程度同源性的基因, 该技术在体外模拟达尔文进化的过程, 大大提高了基因体外定向进化的速度和效率。

DNA-family -shuffling 技术与单基因shuffling 相比, 具有两个明显的优势:首先, 改良效率高。Crameri A 等[2] 在实验中选用了4 种同源性为58 ～ 82%的来自不同菌属的头孢菌素C酶基因作为亲本, 改组后使酶活性增加了270 ～ 540 倍, 而单基因shuffling 只增加了8 倍。其次, 提高了突变机率。由于基因家族改组的块交换特性(block -exchange nature), 使得突变的几率大大提高了, 前例中β 内酰胺酶基因在3 次单基因改组循环后, 只得到了一株4 个突变氨基酸的突变株, 而四个头孢菌素C 酶基因在一次DNA-family -shuffling 后就产生了102 ～196 个突变氨基酸的突变株。

StEP

StEP(Staggered extension process, 交错延伸程序)是指在一个反应体系中以两个以上相关的DNA 片段为模板, 进行类似PCR 反应, 合成在目的基因两侧的引物, 引物先在一个模板链上延伸, 随之进行多轮变性和短暂的复性-延伸循环。每次循环被延伸的片段在复性时与不同的模板配对, 并延伸一段非常短的距离。由于模板的改变, 所合成的DNA 片段中包含了不同模板DNA 的信息。这种交错延伸过程继续进行, 直到获得全长的基因。

StEP 在效果上与DNA shuffling 技术是类似的, 但与之相比省去了用DNA 酶切割成片段的过程, 因而更为简便。StEP 技术的关键在于找到一个可以使引物退火(T退火>Tm -25 ℃)但又降低聚合酶反应速率或降低延伸温度的反应条件, 使得片段可以随机杂交到包含不同突变的模板上。

无PCR的shuffling

该方法利用一些限制性内切酶(如Fok 和Bbv 等), 其识别位点位于切割位点上游或者下游若干碱基处, 对亲本序列切割后生成的黏端通常是各不相同且非回文序列的黏端, 酶切后用连接酶连接, 得到顺序正确的重组装基因文库。该方法由王强等于2004 年提出, 他们构建了一个微型shuffling 文库, 其亲本分别为人组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator , tPA)基因以及含有7 个突变位点的tPA 基因。此方法操作相对简便, 然而, 因为只有能产生彼此不同且非回文序列黏端的内切酶可以使用, 此方法受到内切酶酶切位点特异性的限制, 使得DNA 片段化的随机性较低, 还需要进一步完善。

SCRATCH

SCRATCH 技术是DNA shuffling 与ITCHY (Incremental truncationfor the creation of hybrid enzymes, 产生杂交酶的增加平截技术)相结合而产生的技术, 先将两个相关酶基间经单酶切打开一个切口, 为外切酶Exo Ⅲ 提供作用位点, Exo Ⅲ 每隔一定时间(如30s)取一次样、灭活。然后将两基因的酶解产物混合,平端连接, 生成ITCHY 库, 再以ITCHY 库作为亲本进行DNAshuffling 。

一般来说, DNA shuffling 不能用于改组同源性低于70% ～80%的基因, 而SCRATCH 具有不依赖基因序列的同源性而产生多个DNA 杂交位点的特点。

RACHITT

RACHITY(Random Chimeragenesis on Transient Templates , 过渡模板随机嵌合技术)将某一亲本基因作为临时DNA 模板, 将另一亲本基因(不同种或属)进行酶切与临时模板进行杂交,然后退火延伸连接成新链, 此时由于错配或叠交将产生突变,形成突变基因库。较报道的体外重组而言, RACHITT 是杂交次数最多的方法, 可以减少重排片断的大小, 并增加每个基因的重组机率。

体外exon shuffling

体外exon shuffling是模拟自然界外显子洗牌的过程, 在建立好的同源基因文库中, 设计与各作为模板的同源基因的内含子有同源性的嵌合寡核苷酸, 以此作为引物进行扩增, 得到内含子-外显子嵌合的片段, 此后再以扩增产物自身作为引物和模板进行PCR 反应, 获得全长突变基因库。该技术不局限于某单个基因的范畴, 而是将每个外显子编码的折叠结构域作为单位, 因此, 体外exon shuffling 可以将多个不同功能的蛋白作为亲本, 产生不同特性的突变基因库,引入更多的理性设计。

抗生素是生物医药的主要产品之一。但大量使用的结果导致病菌耐药性的增强。1998年,Crameri等选用四个编码头胞霉素的基因进行DNAfamilyshuffling的改造提高的表达量比野生型的高34-68倍。Yano等在改造大肠杆菌对青霉素的抗性时也获得了对其他抑制细胞壁形成的药物的抗性。在疫苗和抗体;细胞因子;生长因子等方面也得到了应用。

工业用酶常需表达量高,活性强,能耐酸碱等极端环境。枯草菌素来自枯草杆菌是一种具有商业价值的丝氨酸水解酶。在改造后在对底物的活性、温度敏感性、溶剂稳定性和pH值的依赖性都优于最佳亲本。提高工业上的其他酶类如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、漆酶、纤维素酶等在非生物环境下的稳定性,特异性。

反转录病毒是人类基因治疗的一种载体,但用常规培养工艺需将浓度提高100倍,因此常用超速离心等物理方法。但反转录病毒在这些方法中极不稳定,而丧失活性,这可能与病毒外壳蛋白组分有关。小鼠C型反转录病毒外壳蛋白由两个亚基SU(gP70)和TM(PISE)组成,它们负责与细胞受体结合并与质膜融合。SU和TM是由不稳定的二硫键结合在一起的,反转录病毒的不稳定性是因为SU结构域的丧失。用DNAshuming的方法得到一批含复杂成分的重组外壳蛋白,并对超速离心具有抗性、稳定性高于亲本30-100倍的新病毒系。同样使用该方法得到了新的牛痘疫苗。

Cigan等改造了从Pentadethra这种植物中获得杀虫基因获得了新的pentin-l杀虫基因,并申请了专利。Mepherson等则用DNA shuffiing等技术改善蛋白酶抑制剂的性质从而对广泛的线虫种群有很好的抗性。

将一个可以把除草剂“劳去净”脱氯的蛋白质经过多轮DNA shuffiing和筛选得到一个有n个氨基酸突变的新基因,用于城市污水处理系统。Kumamaru等在1998年和Fumkawa等在1995年通过改造降解PCB(多氯联苯)的代谢途径中的一些酶类来提高降解能力和范围。